2027학년도 · 고등학교 전문교과 · 생화학

3.3 단백질의 연구

분리와 정제, 전기영동, 혼합 시료의 정량.

3 SECTIONS표 5그림 20인쇄 지원

01

3.1 단백질은 분리되고 정제될 수 있다

전기영동 이동은 전하·크기·형태의 조합으로 결정, SDS로 변성하면 크기 지배적
SDS-PAGE = 음전하를 균일하게 부여해 질량 대비 이동도(Rf)로 겉보기 분자량 추정
표준 단백질의 log(분자량) vs Rf 표준곡선을 이용해 미지 밴드의 크기 산출
Native PAGE(구조·복합체 유지)·IEF(pI)·2D 전기영동(pI + 크기)은 각각 다른 정보 제공
밴드가 하나라는 사실만으로 순수·동일 단백질이라 단정할 수 없음

총단백질량(mg) = 농도(mg/mL) × 부피(mL)

총활성(U) = 활성 농도(U/mL) × 부피(mL)

비활성(U/mg) = 총활성(U) / 총단백질량(mg)

누적 정제배수 = 해당 단계 비활성 / 최초 단계 비활성

누적 수율(%) = 해당 단계 총활성 / 최초 단계 총활성 × 100

그림 3.3-1단백질 분리·정제의 전체 흐름. 단계별 결과는 수치와 실험 결과로 점검해야 한다.

그림 3.3-2시료 파쇄·용해와 원심분리 후 분획의 단순화된 모형.

그림 3.3-3이온교환·크기배제·친화 크로마토그래피에서 이용하는 서로 다른 분리 특성.

표 3.3-1주요 크로마토그래피 방법의 분리 원리

그림 3.3-4음전하 수지에 양전하 단백질이 흡착되는 양이온 교환의 개념도.

그림 3.3-5큰 단백질이 기공 내부에 덜 들어가 먼저 용출되는 크기배제 분리의 모형.

그림 3.3-6시료 주입, 세척, 용출로 이루어진 친화 크로마토그래피의 단순화된 단계.

그림 3.3-7흡광도·표적 활성·염 농도 구배가 함께 제시된 모의 크로마토그램. 색으로 강조한 구간은 회수 후보이다.

표 3.3-2계산 예제의 정제 표

그림 3.3-8가상 정제 공정에서 정제배수 증가와 수율 감소가 동시에 나타나는 모형.

02

3.2 전기영동으로 단백질을 분리하고 그 특징도 알아낼 수 있다

정량 대상 정의가 먼저 = 총단백질인지 특정 단백질인지에 따라 방법이 다름
A280 = Trp·Tyr 흡광, 시약 없이 빠르지만 단백질별 ε 차이와 핵산 간섭 존재
Bradford(595nm)·BCA(562nm)·뷰렛(540nm)은 발색 반응으로 총단백질 농도 측정
표준곡선과 희석배수를 곱해 원액 농도 산출
특정 단백질은 항체(웨스턴블롯·ELISA) 또는 특이적 활성으로 검출
겔 밴드 밀도 정량은 선형 범위·염색 편차·반복 측정 한계를 고려

Rf = 밴드 이동 거리 / 염료 전선 이동 거리

그림 3.3-9SDS 처리를 통해 단백질이 변성된 폴리펩타이드 사슬로 바뀌는 개념도.

그림 3.3-10정제 단계별 SDS-PAGE 밴드 패턴의 모의 이미지. 실제 측정이 아니다.

표 3.3-3모의 SDS-PAGE 표준품: 분자량과 Rf

그림 3.3-11분자량 표준 단백질의 상대 이동도와 log₁₀(M)의 관계를 계산한 예시.

그림 3.3-12Native PAGE와 SDS-PAGE의 분리 결과를 해석할 때 고려하는 특성의 차이.

그림 3.3-13등전점과 겉보기 분자량을 함께 표현한 가상의 2차원 전기영동 점 지도.

표 3.3-4전기영동 방법 비교

03

3.3 분리하지 않은 혼합 시료의 단백질도 정량화할 수 있다

1. 정량화할 대상부터 명확히 정의한다

혼합 시료를 정제하지 않아도 총단백질 농도를 측정할 수 있ㅁ
그러나 이 값은 시료 안에 있는 특정 단백질의 농도와 같지 않ㅁ
예를 들어 세포 추출액의 Bradford 정량은 일반적으로 모든 단백질이 발색에 기여한 결과이며, 특정 효소의 양을 알고 싶다면 선택적 분석이 추가로 필요하ㅁ
연구 질문을 “총단백질이 얼마인가?”와 “표적 단백질이 얼마인가?”로 분리해야 분석법을 올바르게 선택할 수 있ㅁ

그림 3.3-14총단백질과 특정 단백질의 정량 목표에 따른 분석법 선택.

2. 280 nm 자외선 흡광도(A280)와 람베르트–베르 법칙

단백질의 트립토판(Trp)과 티로신(Tyr), 일부 이황화결합은 약 280 nm에서 자외선을 흡수한ㅁ
아미노산 구성과 결합 상태에 따라 몰흡광계수 ε가 달라진ㅁ
잘 정제된, 성분을 아는 단백질에서는 A280을 측정하여 농도를 추정할 수 있ㅁ
하지만 혼합물에서는 단백질마다 ε가 다르고 핵산 등 다른 성분이 간섭할 수 있으므로 단일 흡광도만으로 정확한 총단백질 농도를 보장할 수 없ㅁ

그림 3.3-15흡광도 측정과 A=εcl 관계를 설명하는 개념도.

A = ε·c·l (ε: L·mol⁻¹·cm⁻¹, c: mol/L, l: cm)

3. 발색 반응으로 총단백질 농도를 측정한다

Bradford 분석에서는 Coomassie Brilliant Blue 색소가 단백질에 결합할 때 흡광 특성이 바뀌는 현상을 이용한ㅁ
일반적으로 595 nm 부근에서 신호를 읽는ㅁ
BCA 분석은 단백질이 알칼리성 환경에서 Cu²⁺를 Cu⁺로 환원시키는 반응과 BCA-Cu⁺ 착물의 발색을 이용하며 보통 562 nm에서 측정한ㅁ
뷰렛 반응은 알칼리성 용액에서 구리 이온과 펩타이드 결합이 착물을 형성하는 현상을 이용한ㅁ
서로 다른 분석법은 감도·간섭물질·단백질별 신호에 차이가 있ㅁ

그림 3.3-16Bradford·BCA·뷰렛 정량법의 화학적 원리와 대표 측정 파장의 비교.

표 3.3-5단백질 정량 방법

실제 호환성은 시약 제품과 사용한 완충액 조건에 따라 달라진ㅁ
시료에 강한 환원제가 존재하면 BCA가 과대 발색할 수 있으며, 계면활성제는 Bradford 반응에 영향을 줄 수 있ㅁ
표준액과 시료의 매질을 가능한 한 맞추고, 각 방법의 공백시험(blank) 및 권장 농도 범위를 준수해야 한ㅁ

4. 표준곡선과 희석배수를 이용한 농도 계산

농도를 알고 있는 표준 단백질(BSA 등)로 여러 표준액을 만든 뒤 흡광도를 측정하면 검량선을 얻을 수 있ㅁ
검량선이 유효한 선형 구간에서 미지 시료의 흡광도를 대입해 희석액 농도를 구하고, 마지막에 원액의 희석배수를 곱한ㅁ
0 mg/mL 표준액도 색소 자체의 흡광도가 나타날 수 있으므로 반드시 공백값을 고려한ㅁ

그림 3.3-17Bradford 정량의 가상 선형 검량선. 측정점과 추정값 모두 수업용 모의 데이터이다.

A = 0.045 + 0.625c → c = (A − 0.045)/0.625 (c: mg/mL)

5. 특정 단백질은 항체나 특이적 활성을 이용해 검출한다

Western blot은 겔에서 단백질을 분리하고 막으로 옮긴 뒤 표적을 인식하는 항체로 검출하는 방법이ㅁ
샌드위치 ELISA는 보통 고정화한 포획 항체와 표지된 검출 항체를 사용해 항원 신호를 얻는ㅁ
표적 특이성이 충분히 검증되고 표준곡선이 마련되어 있으면 절대 농도에 가까운 정량도 가능하ㅁ
그러나 항체의 교차반응·표준품 차이·검출기 포화 때문에 모든 Western blot과 ELISA가 자동으로 절대 정량법이 되는 것은 아니ㅁ

그림 3.3-18혼합 시료 속 특정 단백질을 검출하는 Western blot과 샌드위치 ELISA의 기본 절차.

표적이 효소라면 특정 기질에 대한 반응 속도도 기능성 지표가 된ㅁ
다만 효소 활성은 온도·pH·저해제 등에 좌우되므로 효소 분자 개수와 일대일 대응하지 않을 수 있ㅁ
표적 단백질의 물질량, 촉매 능력, 검출 신호는 서로 다른 측정 대상임을 구분한ㅁ

6. 전기영동 밴드의 밀도와 반복 측정의 한계

겔 이미지에서 밴드별 적분 강도의 합에 대한 표적 밴드 강도의 비율을 구하면 겔 염색 반응을 이용한 대략적인 상대 순도 지표를 얻을 수 있ㅁ
그러나 밴드가 겹치거나 염색 강도가 단백질마다 다를 수 있으므로 이 비율을 곧바로 정확한 단백질 질량비로 동일시하지 않는ㅁ
정량 실험은 반복하여 평균과 산포를 보고하고 공백값 보정, 희석 오류, 피펫 사용 오차를 평가해야 한ㅁ

그림 3.3-19가상 겔 밴드 강도에서 표적 밴드 비율 85%를 계산하는 예시. 화학적 순도를 보장하는 수치는 아니다.

그림 3.3-20Bradford 검량선의 가상 반복 측정 3회에서 추정한 희석액 농도 변화. 실제 실측값이 아니다.

참조 자료 · References

**표 3.3-1**주요 크로마토그래피 방법의 분리 원리
방법	주요 분리 기준	핵심 원리	해석 시 주의점
이온교환(IEX)	표면 전하	반대 전하를 띤 수지에 가역적 결합	pH·염 농도에 따라 흡착 변화
크기배제(SEC)	수화 반지름	작은 분자는 기공에 접근해 체류 증가	큰 분자가 일반적으로 먼저 용출
친화(AC)	리간드 인식	표적-리간드의 선택적 결합	비특이 결합·용출 조건 확인
소수성 상호작용(HIC)	소수성 표면	염 조건에 따라 소수성 결합 변화	변성 가능성과 적절한 조건 확인

**표 3.3-2**계산 예제의 정제 표
정제 단계	부피(mL)	전체 단백질(mg)	총활성(U)	비활성(U/mg)	정제배수	누적 수율(%)
조추출액	100	2,000	20,000	10	1.0	100
염석 분획	40	600	16,800	28	2.8	84
이온교환	20	160	12,800	80	8.0	64
크기배제	12	50	8,500	170	17.0	42.5
친화 정제	4	12	7,200	600	60.0	36

**표 3.3-3**모의 SDS-PAGE 표준품: 분자량과 Rf
표준 분자량(kDa)	150	100	75	50	37	25	15
모의 Rf	0.17	0.26	0.34	0.46	0.55	0.67	0.80

**표 3.3-4**전기영동 방법 비교
방법	주요 분리 기준	유지될 수 있는 상태	대표 활용
SDS-PAGE	변성 사슬의 겉보기 크기	대부분 고차 구조 소실	분자량·분리 상태 평가
Native PAGE	전하+형태+크기	일부 구조·활성·복합체	복합체·동질체 분석
IEF	등전점(pI)	조건에 따라 다름	전하·pI 차이 분석
2D 전기영동	pI와 겉보기 크기	대개 2차원 단계에서 변성	복잡한 시료의 다중 단백질 분리

**표 3.3-5**단백질 정량 방법
정량법	대표 파장	장점	주의할 간섭·한계
A280	280 nm	시약 없이 빠른 측정	ε가 단백질마다 다름·핵산 간섭
Bradford	약 595 nm	빠른 발색·교육용 활용 쉬움	계면활성제 간섭·단백질별 반응 차이
BCA	약 562 nm	넓은 농도 범위·많은 계면활성제에 비교적 안정	환원제·킬레이트제 간섭
뷰렛	약 540 nm	펩타이드 결합 원리 설명에 적합	상대적으로 감도가 낮음

단백질 분리·정제의 전체 흐름. 단계별 결과는 수치와 실험 결과로 점검해야 한다. — 그림 3.3-1단백질 분리·정제의 전체 흐름. 단계별 결과는 수치와 실험 결과로 점검해야 한다.

시료 파쇄·용해와 원심분리 후 분획의 단순화된 모형. — 그림 3.3-2시료 파쇄·용해와 원심분리 후 분획의 단순화된 모형.

이온교환·크기배제·친화 크로마토그래피에서 이용하는 서로 다른 분리 특성. — 그림 3.3-3이온교환·크기배제·친화 크로마토그래피에서 이용하는 서로 다른 분리 특성.

음전하 수지에 양전하 단백질이 흡착되는 양이온 교환의 개념도. — 그림 3.3-4음전하 수지에 양전하 단백질이 흡착되는 양이온 교환의 개념도.

큰 단백질이 기공 내부에 덜 들어가 먼저 용출되는 크기배제 분리의 모형. — 그림 3.3-5큰 단백질이 기공 내부에 덜 들어가 먼저 용출되는 크기배제 분리의 모형.

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흡광도·표적 활성·염 농도 구배가 함께 제시된 모의 크로마토그램. 색으로 강조한 구간은 회수 후보이다. — 그림 3.3-7흡광도·표적 활성·염 농도 구배가 함께 제시된 모의 크로마토그램. 색으로 강조한 구간은 회수 후보이다.

가상 정제 공정에서 정제배수 증가와 수율 감소가 동시에 나타나는 모형. — 그림 3.3-8가상 정제 공정에서 정제배수 증가와 수율 감소가 동시에 나타나는 모형.

SDS 처리를 통해 단백질이 변성된 폴리펩타이드 사슬로 바뀌는 개념도. — 그림 3.3-9SDS 처리를 통해 단백질이 변성된 폴리펩타이드 사슬로 바뀌는 개념도.

정제 단계별 SDS-PAGE 밴드 패턴의 모의 이미지. 실제 측정이 아니다. — 그림 3.3-10정제 단계별 SDS-PAGE 밴드 패턴의 모의 이미지. 실제 측정이 아니다.

분자량 표준 단백질의 상대 이동도와 log₁₀(M)의 관계를 계산한 예시. — 그림 3.3-11분자량 표준 단백질의 상대 이동도와 log₁₀(M)의 관계를 계산한 예시.

Native PAGE와 SDS-PAGE의 분리 결과를 해석할 때 고려하는 특성의 차이. — 그림 3.3-12Native PAGE와 SDS-PAGE의 분리 결과를 해석할 때 고려하는 특성의 차이.

등전점과 겉보기 분자량을 함께 표현한 가상의 2차원 전기영동 점 지도. — 그림 3.3-13등전점과 겉보기 분자량을 함께 표현한 가상의 2차원 전기영동 점 지도.

총단백질과 특정 단백질의 정량 목표에 따른 분석법 선택. — 그림 3.3-14총단백질과 특정 단백질의 정량 목표에 따른 분석법 선택.

흡광도 측정과 A=εcl 관계를 설명하는 개념도. — 그림 3.3-15흡광도 측정과 A=εcl 관계를 설명하는 개념도.

Bradford·BCA·뷰렛 정량법의 화학적 원리와 대표 측정 파장의 비교. — 그림 3.3-16Bradford·BCA·뷰렛 정량법의 화학적 원리와 대표 측정 파장의 비교.

Bradford 정량의 가상 선형 검량선. 측정점과 추정값 모두 수업용 모의 데이터이다. — 그림 3.3-17Bradford 정량의 가상 선형 검량선. 측정점과 추정값 모두 수업용 모의 데이터이다.

혼합 시료 속 특정 단백질을 검출하는 Western blot과 샌드위치 ELISA의 기본 절차. — 그림 3.3-18혼합 시료 속 특정 단백질을 검출하는 Western blot과 샌드위치 ELISA의 기본 절차.

가상 겔 밴드 강도에서 표적 밴드 비율 85%를 계산하는 예시. 화학적 순도를 보장하는 수치는 아니다. — 그림 3.3-19가상 겔 밴드 강도에서 표적 밴드 비율 85%를 계산하는 예시. 화학적 순도를 보장하는 수치는 아니다.

Bradford 검량선의 가상 반복 측정 3회에서 추정한 희석액 농도 변화. 실제 실측값이 아니다. — 그림 3.3-20Bradford 검량선의 가상 반복 측정 3회에서 추정한 희석액 농도 변화. 실제 실측값이 아니다.

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